拿什么去分析你，单细胞迁移的行为？

锘海生物科学发布时间：2018/07/30 11:14 点击: 加载中..

拿什么去分析你，单细胞迁移的行为？

细胞迁移 (cell migration)是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞和细胞之间形成粘着斑(focal adhesion), 细胞迁移的过程即以粘着斑作为定位点产生牵引力，穿过基质向目的地移动。在胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。细胞迁移是目前细胞生物学研究的一个主要课题，科学家们试图通过对细胞迁移的研究，在阻止癌症转移、异体植皮等医学应用方面取得更大成果。

为了模拟体内细胞迁移的过程，现在有几种分析方法在2D层面上来细胞迁移：1) 划痕检测（the scratch assay），2）细胞排斥区分析（cell-exclusion zone assay），3）微流控技术（microfluidic technology）。

l 划痕检测是指当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为\"划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使\"划痕”愈合。通过计算划痕愈合的时间从而间接了解细胞迁移的速度。

l 细胞排斥区分析是让细胞在孔的底部围绕一个阻止细胞生长的区域（如在孔底部中央放置阻塞物）生长。试验在移除阻塞物后开始，可观察单层细胞迁移到原先的空白区域中。适用于无外界损伤因素的迁移实验。

l 利用微流控技术研究细胞迁移，是通过微流控结构两端的开口，将细胞加入一边的开口使其下沉到底部。然后在另一端的开口加入趋化试剂形成梯度或引入血流等外界物理因素，用显微镜观测细胞迁移。

以上几种方法均可以从群体层面(Population level)上对细胞迁移进行间接分析，但是仍然无法解释以下几个问题：

l 细胞增殖对划痕愈合的影响

l 前缘细胞（leading edge cells）的行为和其他细胞的区别

l 每一颗细胞迁移的速度

l 每一颗细胞迁移的方向

l 每一颗细胞迁移的轨迹

l 迁移过程中每一颗细胞发生的形态变化

来自英国Phasefocus公司的Livecyte 提供一种全新不通过物镜的长时间细胞成像方式，它可以同时针对群体和单细胞行为进行分析。另外非侵入性的检测方式（非标记，超低光毒性）保证了细胞不受破坏，在长时间的生长过程中维持更真实的行为变化。拥有超大的视野（FOV）的Livecyte在进行分析时不用拼接图像。因此在分析细胞群体行为时有足够多的细胞，从而提供统计学上有意义的结果，例如：划痕的愈合，细胞的增殖。同时，单细胞的行为变化（例如：形态和迁移）也进行单独分析，因为Livecyte可以提供定量且有高对比度的图像。Livecyte系统比起传统的成像方式（例如：明场，荧光和相差）提供了一种更深入的研究细胞迁移和划痕的方式。

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? 案例分析

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这是一组通过MDA MB231乳腺癌细胞进行的划痕实验，细胞培养24小时以后，对照组和实验组分别加入1% BSA\\HBSS和50μM LPA。Livecyte对细胞进行了长达48小时的连续拍摄，每10分钟拍一次，最后通过自带的CAT (Cell Analysis Toolbox) 分析系统进行分析。

细胞群体水平分析

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图二：划痕愈合的速度以及1/2划痕愈合的时间。白线为对照组，红线为实验加药组。

实验组和对照组划痕愈合的时间以及速度分别为：21.4小时，5.3μM/小时和41.9小时，2.5μM/小时（图二）。但划痕的愈合不仅受细胞迁移的影响，也受细胞增殖的作用。

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图三：所有细胞干质量的变化。白线为对照组，红线为实验加药组。

Livecyte通过计算视野里面所有细胞的干质量，计算出细胞增殖对划痕愈合的影响。在这一组实验里面，50μM LPA 在16个小时以后增加了细胞的增殖速度（图三）。

因此，当分析细胞群体行为时，我们可以得出一个结论，在16个小时以后细胞的迁移和细胞的增殖都对划痕的愈合有影响。

单细胞水平分析

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图四：Livecyte独特的成像方式提供了高对比度的图像，使得视野里面每一颗细胞都可以被追踪且被分析。

除了分析细胞群体的行为，Livecyte也可以直接分析划痕中前缘（leading edge）中单个细胞的行为变化（图四）。

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图五对划痕前缘的单细胞行为进行统计分析

通过追踪这些前缘细胞（leading edge cells）,我们可以明显的知道50μM LPA增加了细胞的平均速度和瞬时速度。LPA也影响了细胞迁移的蜿蜒指数(Meandering index)，即细胞的迁移行为也被药物影响。Livecyte也可以分析细胞在迁移过程中形态的变化，例如：细胞的面积，厚度，圆形程度以及横款比。50μM LPA 加药处理引起了细胞变厚变圆，所以细胞的横款比相对的降低（图五）。

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Livecyte-定量非标记活细胞成像及分析系统利用其独特的叠层衍射成像技术(Ptychography)以及自带的强大软件分析系统提供一种非标记、超低光毒性的检测方式，自动对细胞群体和每一颗细胞进行长时间的形态（面积，厚度，周长，体积等）以及动态（距离，速度，方向，蜿蜒程度等)进行定量分析。从而对细胞群体以及单个细胞进行前所未有的深入分析，得到更有说服力的数据。

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